Kultur

Material und Methode

Material

Tumorpatienten mit verhornendem Plattenepithelkarzinom Ösophagus, Melanosarkom, Mammakarzinom (4 Fälle), M. Hodgkin (2 Fälle), Magenkarzinom, Bronchuskarzinom, Hepatom, Leberkarzinom, malignes Lymphom, Blasenkarzinom, Sarkom, Hypernephrom, St.p.Ca. linguae, Neoplasma linkes Schläfenbein, Cyst. Basaliom r. Schläfenbein, Dickdarmkarzinom, Rectumkarzinom, mehrst. Melanom, Zungenkarzinom, Prostatakarzinom, Ösophaguskarzinom, Leukämie. Als Kontrollen wurden Patienten mit Hepatitis, Hyperurikämie, Pyelitis, Lues, Hypertonie, Psoriasis, chron.Tonsillitis, Nierensteinen und 5 gesunde Probanden herangezogen. Für die Diagnosen und das Material habe ich Herrn MR Dr. Rudolf Pekar zu danken.

Methode

Kulturmedium:

  1. 35g Bäckerhefe mit 25ml einer 20% igen wässrigen KOH-Lösung bei 36°C 24h lang inkubieren.
  2. 10ml der Suspension mit 50ml Aqua dest. verdünnen.
  3. 6g Bacto Beef (Difco) in 12ml 20%iger wässriger KOH Lösung anfeuchten.
  4. 0,7g Proteose Pepton (Difco) in 20ml Aqua dest. lösen.
  5. Die in Punkten 3 und 4 genannten Lösungen verrühren und 6h lang bei 36°C inkubieren.
  6. 1g D(+)-Glukose (Merck) in 10ml Aqua dest. lösen.
  7. Die unter 2, 5, 6 genannten Lösungen mischen und je 5ml davon in Kulturröhrchen aus Duran mit Kunststoffkappen für die Mikrobiologie abfüllen. Sterilisation in einem Dampf-Sterilisator.
  8. Der pH-Wert dieses Mediums beträgt 12,5

Kulturansatz :

  1. 2ml einer 7,5%igen wässrigen KOH – Lösung werden mit 1ml Heparinblut 8h bei 37°C inkubiert.
  2. 0,5ml des Bodensatzes werden in das Kulturmedium gebracht.
  3. Aerobe Kulturen werden bei 30°C  7 Wochen inkubiert

Präparation:

  1. Zentrifugation der über dem Bodensediment befindlichen Flüssigkeit bei 3500 U/15 min.
  2. Absaugen des Überstandes und 1h fixieren in Carnoy’schem Gemisch.
  3. Suspension auf einen gut gereinigten Objektträger ausstreichen und trocknen.
  4. Färbung nach Giemsa.
  5. Parallel dazu Fixierung in gep. Glutaraldehyd und Präparation für das REM und TEM, wie schon vorher beschrieben.

Weiterkultur auf Mykoplasma - Agar und – Bouillon (Merck) mit Zusatz von inaktiviertem Mykoplasma -freiem Lammserum.

 

Ergebnisse

Insgesamt wurden vom Blut der Tumorpatienten 48 Kulturen angelegt und untersucht, davon waren 43 positiv, 3 unsicher und 2 negativ. Als Kontrollen wurden 4 Kulturen des Mediums allein die alle negativ waren , 5 Kulturen von gesunden Probanden von denen eine positiv war und 12 Kulturen von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen untersucht, von denen die Fälle mit chr. Tonsillitis, Pyelitis (86a) und Lues (59a) positiv waren. Die Ergebnisse der Kulturansätze zeigten, dass bei Krebspatienten mit unterschiedlichem Befund mit unserer Isolationsmethode vermehrungsfähige Mikroorganismen signifikant häufiger (90% positiv,6% unsicher, 4% negativ) als bei Patienten mit anderen Erkrankungen (25% positiv, 75% negativ) und bei klinisch gesunden Patienten (20% positiv, 80% negativ) vorhanden waren. Der lichtmikroskopische Nachweis nach Giemsafärbung zeigte im negativen Fall eine fein granuläre zart gefärbte Struktur. Im Falle eines positiven Ergebnisses fand sich eine dunkelviolett gefärbte grob granuläre Struktur (siehe Abb.4 und Abb.5).

Nach dem Übertragen der unfixierten Suspension aus positiven Kulturen auf Mykoplasma-Agar fanden sich Kolonien in Spiegeleiform und in unregelmäßiger Form(siehe Abb. 6a und Abb. 6b). Wurde die Suspension in Mykoplasma - Bouillon übertragen fanden sich nach einer mehrtägigen Inkubation bei 36°C große Mengen an Partikeln, die man im Dunkelfeld deutlich darstellen konnte (siehe Abb.7). Auch elektronenmikroskopisch wurden diese Partikel aus der Kultur von uns untersucht. Im REM fanden sich im Mittel 0,25µm große Partikel, aber auch Ringe (siehe Abb. 8 und Abb.9). Im TEM fanden wir bis 0,5 µm große meist runde Strukturen, bei den größeren Objekten mit einer dicken Zellwand (siehe Abb. 10 , Abb.10a und Abb. 11).

 

Abb. 4 Partikel (Basoplasma sanguineum), Mamma –Karzinom, Giemsafärbung, Vergrößerung 1600 : 1, positiv. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 5 Partikel (Basoplasma sanguineum) ,verhornendes Plattenepithel - Ca des Ösophagus, Giemsafärbung, Vergrößerung 1600 : 1, positiv. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 6a  Kolonien der Partikel auf Mykoplasma – Agar (Merck) mit Zusatz von Mykoplasma- freiem inaktiviertem Lammserum. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 6b  Kolonien der Partikel (Basoplasma sanguineum)  auf Mykoplasma – Agar (Merck) mit Zusatz von Mykoplasma- freiem inaktiviertem Lammserum.

 

Abb. 7 Vermehrung der Partikel (Basoplasma sanguineum),  Mamma-Ca, in Mykoplasma - Bouillon (Merck) mit Zusatz von Mykoplasma- freiem inaktiviertem Lammserum, Dunkelfeld, Vergrößerung 1600 : 1. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 8 Partikel (Basoplasma sanguineum)  aus einer positiven Kultur ( verhornendes Plattenepithel- Ca des Ösophagus) nach MF-Methode im REM, Vergrößerung 6250 :1. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 9 Partikel (Basoplasma sanguineum)  aus einer positiven Kultur (Mamma – Ca) direkt auf Deckglas für das REM präpariert, Vergrößerung 6250 : 1. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 10 Aus einer positiven Kultur, Partikel (Basoplasma sanguineum) , verhornendes Plattenepithel – Ca des Ösophagus, für das TEM präpariert, Ultradünnschnitt, kontrastiert mit Uranylazetat/Bleizitrat, Vergrößerung 25 000 : 1. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 10a Aus einer positiven Kultur, Partikel (Basoplasma sanguineum) , verhornendes Plattenepithel – Ca des Ösophagus, für das TEM präpariert, Ultradünnschnitt, kontrastiert mit Uranylazetat/Bleizitrat, Vergrößerung 25 000 : 1. Foto mit besserer Auflösung

 

Abb. 11 Aus einer positiven Kultur, Partikel (Basoplasma sanguineum) , Mamma-Ca,  für das TEM präpariert, Ultradünnschnitt, kontrastiert mit Uranylazetat/Bleizitrat, Vergrößerung 12 500 : 1. Foto mit besserer Auflösung

 

 

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